PCR၊ သည် dNTP၊ Mg2+၊ ရှည်လျားသောအချက်များနှင့် ချဲ့ထွင်ခြင်းဆိုင်ရာအချက်များ ပေါင်းထည့်ခြင်းအား ရည်ညွှန်းသော၊ ၎င်းမှာ မိဘ DNA ပေါ်လီမာရတ်၏ ဓါတ်ပြုမှုအောက်ရှိ စနစ်သို့ dNTP၊ Mg2+၊ ရှည်လျားသောအချက်များနှင့် ချဲ့ထွင်ခြင်းဆိုင်ရာအချက်များ ပေါင်းထည့်ခြင်းကို ရည်ညွှန်းသည့် ၊ denaturation၊ annealing၊ extension စသည်တို့၏ အဆင့်များအားဖြင့်၊ in vitro ပုံစံတူသမီးငယ်ကြိုးမျှင် DNA ၏ လုပ်ငန်းစဉ်သည် မိဘကြိုးမျှင် DNA နှင့် ဖြည့်စွက်ထားသော ပစ်မှတ် DNA တစ်ခုခုကို လျင်မြန်စွာနှင့် အထူးအားဖြင့် ချဲ့နိုင်သည်။
1. Hot Start PCR
သမားရိုးကျ PCR တွင် ချဲ့ထွင်ခြင်းစတင်ချိန်သည် PCR စက်ကို PCR စက်ထဲသို့ ထည့်ရန်မဟုတ်ဘဲ၊ ထို့နောက် ပရိုဂရမ်ကို အသံချဲ့ထွင်ရန် စတင်သည်။စနစ်ဖွဲ့စည်းပုံကို ပြီးမြောက်သောအခါ၊ အကျယ်ချဲ့ခြင်းစတင်သည်၊ အတိအကျမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်ကို ဖြစ်စေနိုင်ပြီး hot-start PCR သည် ဤပြဿနာကို ဖြေရှင်းပေးနိုင်ပါသည်။
hot start PCR ဆိုတာဘာလဲ။တုံ့ပြန်မှုစနစ်ပြင်ဆင်ပြီးနောက်၊ တုံ့ပြန်မှု၏ကနဦးအပူပေးသည့်အဆင့် သို့မဟုတ် “စတင်ပူ” အဆင့်တွင်၊ မြင့်မားသောအပူချိန်တွင် အင်ဇိုင်းမွမ်းမံမှုအား အင်ဇိုင်းမွမ်းမံမှုအား ထုတ်ပေးသည်။တိကျသောအသက်သွင်းချိန်နှင့် အပူချိန်သည် DNA polymerase ၏သဘောသဘာဝနှင့် hot-start modifier ပေါ်တွင်မူတည်သည်။ဤနည်းလမ်းသည် DNA polymerase ၏လုပ်ဆောင်မှုကို ဟန့်တားရန်အတွက် ပဋိပစ္စည်းများ၊ ရင်းနှီးသော ligands သို့မဟုတ် ဓာတုဗေဒပြုပြင်မွမ်းမံမှုများကဲ့သို့သော ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများကို အဓိကအသုံးပြုသည်။DNA polymerase ၏လုပ်ဆောင်မှုကို အခန်းအပူချိန်တွင် ဟန့်တားထားသောကြောင့်၊ hot start နည်းပညာသည် PCR တုံ့ပြန်မှု၏တိကျမှုကိုမထိခိုက်စေဘဲ အခန်းအပူချိန်တွင် PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်များစွာကို ပြင်ဆင်ရာတွင် အလွန်အဆင်ပြေစေပါသည်။
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) သည် mRNA မှ cDNA သို့ ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းအတွက် စမ်းသပ်ချက်တစ်ခုဖြစ်ပြီး ၎င်းကို ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် ပုံစံပလိတ်အဖြစ် အသုံးပြုခြင်း။စမ်းသပ်မှုလုပ်ထုံးလုပ်နည်းသည် တစ်ရှူးများ သို့မဟုတ် ဆဲလ်များတွင် RNA စုစုပေါင်းကို ထုတ်ယူရန်၊ ပထမဦးစွာ Oligo (dT) ကို primer အဖြစ်အသုံးပြုရန်၊ cDNA ကိုပေါင်းစပ်ရန်အတွက် reverse transcriptase ကိုအသုံးပြုကာ၊ ထို့နောက်ပစ်မှတ်ဗီဇကိုရရှိရန် သို့မဟုတ် ပစ်မှတ်မျိုးရိုးဗီဇကိုရှာဖွေရန်အတွက် cDNA ကိုအသုံးပြုရန် ပုံစံပလိတ်အဖြစ်အသုံးပြုပါ။
3. Fluorescent quantitative PCR
Fluorescent quantitative PCR (Real-time Quantitative PCR၊RT-qPCR) သည် PCR လုပ်ငန်းစဉ်တစ်ခုလုံးကို အချိန်နှင့်တစ်ပြေးညီ စောင့်ကြည့်ရန် fluorescent အချက်ပြမှုများကို စုစည်းအသုံးပြုကာ PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်သို့ ချောင်းအုပ်စုများပေါင်းထည့်ခြင်းနည်းလမ်းကို ရည်ညွှန်းပြီး နောက်ဆုံးတွင် ပုံစံပလိတ်ကို အရေအတွက်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် စံမျဉ်းကွေးကို အသုံးပြုခြင်းဖြစ်သည်။အသုံးများသော qPCR နည်းလမ်းများတွင် SYBR Green I နှင့် TaqMan တို့ ပါဝင်သည်။
4. Nested PCR
Nested PCR သည် PCR ချဲ့ထွင်မှု နှစ်ကြိမ်အတွက် PCR primer အစုံနှစ်စုံကို အသုံးပြုခြင်းကို ရည်ညွှန်းပြီး ဒုတိယအချီ၏ ချဲ့ထွင်မှုထုတ်ကုန်သည် ပစ်မှတ် ဗီဇအပိုင်းအစဖြစ်သည်။
ပထမ primers အတွဲ (အပြင်ဘက် primers) သည် တိကျသောမဟုတ်သော ထုတ်ကုန်ကို ချဲ့ထွင်စေပါက၊ တူညီသော သီးခြားမဟုတ်သောဒေသကို ဒုတိယ primers မှ အသိအမှတ်ပြုခံရပြီး ဆက်လက်ချဲ့ထွင်ရန် ဖြစ်နိုင်ခြေ အလွန်နည်းပါးပါသည်။ ဒုတိယ primers အတွဲဖြင့် ချဲ့ထွင်ခြင်း ၊ PCR ၏ တိကျမှုကို မြှင့်တင်ထားပါသည်။PCR နှစ်ကြိမ်လုပ်ဆောင်ခြင်း၏ အားသာချက်တစ်ခုမှာ ၎င်းသည် အကန့်အသတ်ရှိသော စတင်သည့် DNA မှ လုံလောက်သော ထုတ်ကုန်ကို ချဲ့ထွင်ရန် ကူညီပေးသည်။
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR သည် PCR လည်ပတ်မှုဘောင်များကို ချိန်ညှိခြင်းဖြင့် PCR တုံ့ပြန်မှု၏ တိကျမှုကို မြှင့်တင်ရန် နည်းလမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။
touchdown PCR တွင်၊ ပထမစက်ဝန်းအနည်းငယ်အတွက် annealing temperature ကို primers ၏အမြင့်ဆုံး annealing temperature (Tm) ထက် အနည်းငယ်ဒီဂရီသတ်မှတ်ထားသည်။မြင့်မားသောအပူလောင်ခြင်းအပူချိန်သည် တိကျသောမဟုတ်သောချဲ့ထွင်မှုကို ထိရောက်စွာလျှော့ချနိုင်သော်လည်း တစ်ချိန်တည်းတွင် ပိုမိုမြင့်မားသော annealing အပူချိန်သည် primers နှင့် target sequence များကိုခွဲထုတ်ခြင်းကိုပိုမိုဆိုးရွားစေပြီး PCR အထွက်နှုန်းကိုလျော့ကျစေသည်။ထို့ကြောင့်၊ ပထမအကြိမ်အနည်းငယ်တွင်၊ စနစ်အတွင်းရှိပစ်မှတ်မျိုးဗီဇ၏ပါဝင်မှုတိုးမြင့်ရန် စက်ဝန်းတစ်ခုလျှင် 1°C ကျဆင်းသွားစေရန် ပုံမှန်အားဖြင့် သတ်မှတ်ထားသည်။annealing အပူချိန်ကို အကောင်းဆုံးအပူချိန်သို့ လျှော့ချသောအခါ၊ ကျန်ရှိသော စက်ဝန်းများအတွက် annealing temperature ကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။
6. တိုက်ရိုက် PCR
Direct PCR သည် nucleic acid ကို သီးခြားခွဲထုတ်ပြီး သန့်စင်ရန် မလိုအပ်ဘဲ နမူနာမှ DNA ၏ ချဲ့ထွင်မှုကို ရည်ညွှန်းသည်။
တိုက်ရိုက် PCR အမျိုးအစား နှစ်မျိုးရှိသည်။
တိုက်ရိုက်နည်းလမ်း- နမူနာအနည်းငယ်ကိုယူပြီး PCR သတ်မှတ်ခြင်းအတွက် PCR Master Mix သို့ တိုက်ရိုက်ထည့်ပါ။
ကွဲအက်နည်းလမ်း- နမူနာကို နမူနာယူပြီးနောက်၊ lysate ထဲသို့ထည့်ပါ၊ ဂျီနိုမ်ကိုထုတ်ရန်အတွက် lyse၊ lysed supernatant အနည်းငယ်ကိုယူပြီး PCR Master Mix သို့ထည့်ပါ၊ PCR ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်းကို လုပ်ဆောင်ပါ။ဤချဉ်းကပ်မှုသည် စမ်းသပ်လုပ်ဆောင်မှုအသွားအလာကို ရိုးရှင်းစေပြီး လက်လှမ်းမီသည့်အချိန်ကို လျှော့ချပေးပြီး သန့်စင်ရေးအဆင့်များအတွင်း DNA ဆုံးရှုံးမှုကို ရှောင်ရှားသည်။
7. SOE PCR
ထပ်နေသော တိုးချဲ့ဆက်ဆက်မှု PCR (SOE PCR) ဖြင့် မျိုးရိုးဗီဇကို ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့် PCR ထုတ်ကုန်များကို ထပ်နေသောကွင်းဆက်များအဖြစ် ပြုလုပ်ရန် ပေါင်းစပ်အစွန်းကွက်များကို အသုံးပြုသည်၊ ထို့ကြောင့် နောက်ဆက်တွဲ ချဲ့ထွင်မှုတုံ့ပြန်မှုတွင် ထပ်နေသောကွင်းဆက်များ၏ တိုးချဲ့မှုမှတစ်ဆင့်၊ ချဲ့ထွင်ထားသောအပိုင်းအစများ ထပ်နေသော နည်းပညာတစ်ခု၏ မတူညီသောအရင်းအမြစ်များ နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသည်။ဤနည်းပညာသည် လောလောဆယ်တွင် အဓိကအသုံးချလမ်းညွှန်ချက်နှစ်ခုရှိသည်- ပေါင်းစပ်ဗီဇတည်ဆောက်မှု၊gene site-directed mutation။
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) သည် primer နှစ်ခုမှလွဲ၍ အခြား DNA အပိုင်းအစများကို ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် ပြောင်းပြန်အပါအ၀င် primer များကို အသုံးပြုပြီး သိထားသည့် DNA အပိုင်းအစများ၏ နှစ်ဖက်စလုံးတွင် အမည်မသိအစီအစဥ်များကို ချဲ့ထွင်ပေးပါသည်။
IPCR သည် ကပ်လျက်အမည်မသိဒေသများ၏ အစီအစဥ်ကို ဆုံးဖြတ်ရန် မူလက ဒီဇိုင်းထုတ်ထားပြီး ဗီဇမြှင့်တင်ပေးသည့် အစီအစဉ်များကို လေ့လာရန်အတွက် အများအားဖြင့် အသုံးပြုလေ့ရှိသည်။မျိုးရိုးဗီဇပေါင်းစပ်ခြင်း၊ နေရာရွှေ့ပြောင်းခြင်းနှင့် အသွင်ပြောင်းခြင်းကဲ့သို့သော oncogenic chromosomal ပြန်လည်ပြင်ဆင်မှုများ၊ဗိုင်းရပ်စ်မျိုးဗီဇ ပေါင်းစည်းခြင်းတို့ကိုလည်း ယခုအခါတွင် အများအားဖြင့် အသုံးပြုနေကြပြီး site-directed mutagenesis အတွက်၊ အလိုရှိသော ပြောင်းလဲမှုနှင့်အတူ plasmid တစ်ခုကို ကူးယူပါ။
9. dPCR
ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR (dPCR) သည် nucleic acid မော်လီကျူးများ၏ ပကတိပမာဏကို တိုင်းတာရန်အတွက် နည်းလမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။
လောလောဆယ်တွင် nucleic acid မော်လီကျူးများ ပမာဏကို တိုင်းတာရန် နည်းလမ်းသုံးမျိုးရှိပါသည်။Photometry သည် nucleic acid မော်လီကျူးများ၏စုပ်ယူမှုအပေါ်အခြေခံသည်။real-time fluorescent quantitative PCR (Real Time PCR) သည် Ct တန်ဖိုးပေါ်တွင် အခြေခံပြီး Ct တန်ဖိုးသည် ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သည့် fluorescence တန်ဖိုးနှင့် သက်ဆိုင်သည့် သံသရာနံပါတ်ကို ရည်ညွှန်းပါသည်။ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR သည် nucleic acid quantification ကို ရေတွက်ရန်အတွက် တစ်ခုတည်း-မော်လီကျူး PCR နည်းလမ်းကို အခြေခံ၍ နောက်ဆုံးပေါ် Quantitative နည်းပညာဖြစ်ပြီး၊
တင်ချိန်- ဇွန်လ ၁၃-၂၀၂၃